《食品科学》：四川农业大学李建龙博士等：白

　　氨基甲酸乙酯（EC）又名尿烷、乌拉坦，是一种有害的氮代谢产物，具有神经毒性和强致癌性，长期过量接触EC可导致人类神经系统紊乱和肝脏损伤。2007年3月，世界卫生组织国际癌症研究机构将EC列为2A类致癌物。EC存在于各类酒精饮料（黄酒、白酒、葡萄酒）及发酵食品中，其中酒精饮料被认为是人类摄入EC的主要来源。

　　白酒是世界六大蒸馏酒之一，白酒中的EC含量受到越来越多的关注，这促使许多国家制定了限量标准。目前，国内对于白酒中EC的研究多集中于含量调查及检测方法上，对于EC的控制手段研究还较少，筛选更多具有EC降解能力的菌株并将其运用于白酒强化发酵是目前较为可行的方法。

　　四川农业大学食品学院的李超伟、侯晓艳和 李建龙 * 等人从白酒大曲中筛选得到能降解EC且发酵性能优良的细菌和酵母菌，通过响应面试验优化细菌酵母菌共发酵的最佳培养条件，以期为白酒生产过程中EC的调控提供优质的菌种资源，并提高白酒安全性和保障消费者的身体健康。

　　根据菌落形态特征，从白酒大曲筛选得到80 株细菌，接种到以EC作为唯一碳源的筛选培养基中，添加指示剂溴甲酚紫，具有EC降解酶活性的菌株能降解EC生成氨，使培养基pH值上升，溴甲酚紫由黄色变为紫色从而筛选得到目标菌。在含有2 g/L EC的筛选培养基有60 株细菌变色，含有18 g/L EC的筛选培养基有4 株细菌变色。图1为这4 株细菌的EC降解酶活力，不同菌株酶活力之间具有较大的差异。EC降解酶活力从高到低依次为JX2-10、JX1-9、JX1-7和DQ-1；其中JX2-10的EC降解酶活力最高，为1.1 U/mL，与JX1-9、JX1-7和DQ-1之间存在显著差异（

　　如图2所示，4 株细菌所产蛋白酶活力从高到低依次为JX2-10、DQ-1、JX1-9和JX1-7。JX2-10蛋白酶活力最高，为31.6 U/mL，与其余3 株细菌存在显著差异（

　　P＜0.05），JX1-7的蛋白酶活力最低，几乎无活性。综合EC降解酶活力考虑，选择JX2-10作为后续实验菌株。

　　对JX2-10菌落形态特征进行观察，发现该菌株为革兰氏阳性菌，菌落为乳白色，边缘不整齐，质地黏稠，不透明，表面粗糙，菌落直径约为3～5 mm，在显微镜下观察到的菌体为杆状（图3）。提取该菌株全基因组，对16S rDNA基因进行PCR扩增并测序。将获得的16S rDNA序列导入NCBI数据库进行BLAST同源性比对，结果显示，菌株JX2-10与解淀粉芽孢杆菌碱基对同源性为99.93%。运用MEGA-X软件中的邻接法构建系统发育树，结果如图4所示。JX2-10与解淀粉芽孢杆菌处在同一系统发育枝上，结合单菌落形态观察，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌（

　　从大曲分离纯化出52 株酵母菌，通过不断提高筛选培养基中EC的质量浓度对酵母菌进行驯化得到在高质量浓度和低质量浓度EC条件下都能生长的酵母菌，当筛选培养基EC质量浓度为2 g/L时共有20 株酵母菌变色，EC质量浓度为14 g/L时有5 株酵母菌变色。图5为这5 株酵母菌的EC降解酶活力，其中QX-15和QX-2的EC降解酶活力最高，分别为0.82 U/mL和0.80 U/mL，两者之间无显著差异（

　　如图6所示，5 株酵母菌产酯能力从高到低依次为QX-2、QX-15、QX-16、QX-1和QX-3，其中QX-2的产酯能力最强，产生的总酯质量浓度为4.42 g/L，QX-3最弱，为3.32 g/L，其余3 株菌产酯能力相似，无显著差异（

　　对QX-2菌落形态特征进行观察，其菌落呈现规则的圆形，表面隆起，质地黏稠，边缘整齐；在400 倍显微镜下的菌体形态特征为椭圆形或近圆形，一端或多端出芽生殖，成熟细胞内可见液泡（图7）。对菌株进行分子生物学鉴定，结果显示，菌株QX-2与异常威克汉姆酵母碱基对同源性为99.29%。如图8所示，QX-2与异常威克汉姆酵母处在同一系统发育枝上，结合形态学特征，将菌株QX-2鉴定为异常威克汉姆酵母（

　　将JX2-10和QX-2分别接入对应培养基后通过GC-MS法检测24 h内EC质量浓度的变化。由图9可知，JX2-10和QX-2均能显著降解EC，其中JX2-10降解率最高，为85%，QX-2降解率为35%，相比于文献所报道酵母37%的EC降解率显然更具有优势。结合两株菌性能分析，JX2-10和QX-2具有降低白酒发酵过程中EC含量的潜力。

　　如图10A所示，在pH 4.0～7.0范围内蛋白酶活力和总酯质量浓度均有较大的波动，都呈现先升高后降低的趋势，说明pH值对两株菌的共发酵具有重要影响，在pH 4.0～5.0范围内发酵液的总酯质量浓度增加，在pH 5.0时达到最大，为5.35 g/L，在此范围内蛋白酶活力无明显变化，表明在高酸度环境下菌株产酶受到极大抑制，即使减小酸度对于酶活力的提高也无明显效果。在pH 5.0～6.5范围内菌株随酸度的升高总酯质量浓度也提高，表明在菌株适应范围内酸胁迫能促进产酯。有研究表明，酸性环境能诱导产脲酶菌株产更多的脲酶降解尿素，从而生成氨以抵御酸毒害，与此类似，QX-2和JX2-10也可能消耗更多的有机酸生成酯类物质以抵御酸性环境。当初始pH值大于5.0时，蛋白酶活力升高，在初始pH 6.0时蛋白酶活力达到最高，为38 U/mL，随后开始下降。与单菌发酵的产酯能力（4.42 g/L）和酶活力（31.6 U/mL）相比，混菌发酵对于产酯和产酶具有协同效应，能够明显提高产酯能力和酶活力。综上，JX2-10和QX-2共发酵的最佳产酶产酯条件均为酸性环境，能较好地适应白酒发酵。

　　如图10B所示，乙醇体积分数为1%～6%时JX2-10和QX-2共发酵产酯和产蛋白酶能力变化波动大，在1%～3%范围内总酯质量浓度随乙醇体积分数的升高而升高，在3%时达到最大，为5.6 g/L，随后开始下降，在乙醇体积分数为6%时总酯质量浓度最低。蛋白酶活力的变化趋势与总酯质量浓度的变化趋势相似，在乙醇体积分数1%～5%范围内蛋白酶活力升高，最高为33.4 U/mL，继续提高乙醇体积分数后蛋白酶活力陡然下降。总酯质量浓度和蛋白酶活力的变化趋势均为先随乙醇体积分数的升高缓慢升高，随后急速下降，表明较低浓度的乙醇对于共发酵产酶和产酯能力有促进作用，可能与微生物的自我调节能力有关，当乙醇浓度大于某一界限后，蛋白酶活力和产酯能力都受到抑制，说明高体积分数的乙醇溶液对微生物具有毒害作用。

　　由图10C可知，温度升高很大程度上影响了蛋白酶活力和总酯质量浓度，在15～45 ℃范围内总酯质量浓度呈先升高后降低的趋势，在30 ℃时总酯质量浓度达到最大，为5.7 g/L。随着温度的持续升高，蛋白酶活力先缓慢升高，在35 ℃时蛋白酶活力最高，为33 U/mL，与最适产酯温度略有差异，这可能与发酵过程中细菌和酵母的最适温度不同有关。当温度大于35 ℃后，蛋白酶活力降低。蛋白酶活力和总酯质量浓度的变化趋势基本相同，在30 ℃左右达到最大，温度会同步影响与产酯相关的催化酶和蛋白酶活性，造成总酯含量和酶活变化的趋同性。

　　由图10D可知，发酵液的总酯质量浓度整体先升高后降低，在接种浓度为 5×10 5 CFU/mL时达到最高值，随后开始下降，这可能是由于接种量过大，菌体密度高竞争激烈，使得菌体营养供给不足，若接种量过低，菌体繁殖速度慢也会导致发酵液总酯含量下降。发酵液的蛋白酶活力随着接种浓度的提高整体呈现上升趋势，在较低浓度范围内（ 1×10 4 ～5×10 5 CFU/mL）变化趋势不明显，当接种浓度达到5×10 6 CFU/mL时蛋白酶活力最高，为37 U/mL，由于在1×10 4 ～5×10 6 CFU/mL接 种浓度范围内蛋白酶活力未出现明显下降趋势，因此不考虑将接种浓度作为一个因素进行之后的响应面分析。

　　JX2-10、QX-2共发酵优化设计方案与结果如表2所示。通过使用Desingn-Expert 8.0.6软件对回归模型方差分析的结果进行多元二次回归拟合，得到蛋白酶活力的二元多项式回归方程为 Y 1 ＝41.35＋0.96×

　　A＋0.54×B＋0.46×C＋0.46×AB－0.067×AC＋0.25×BC－3.85×A2 －1.11×B2 －2.02×C2 ，根据回归方程线性项系数可知，各因素对蛋白酶活力的影响由大到小依次为A＞B＞C。总酯质量浓度的二元多项式回归方程模型为Y2 ＝5.76－0.082×A－0.073×B－0.088×C－0.017×AB－0.27×AC＋0.059×BC－0.33×A2 －0.27×B2 －0.20×C2 ，根据回归方程线性项系数可知，各因素对总酯质量浓度的影响由大到小依次为CAB。为验证方程的可靠性，对共发酵蛋白酶活性和总酯质量浓度的相关实验数据进行方差分析，结果如表3、4所示。各响应值构建的模型均存在显著差异（P＜0.05），失拟项均无显著差异（P＞0.05），表明相应模型呈现出的结果能够较科学地描述各因素水平与响应值间的关系，说明根据该回归方程拟合得到的最优条件可靠。

　　如图11a所示，在初始pH 5.2～5.8、培养温度27～33 ℃范围内蛋白酶活力达到最大，初始pH值和培养温度交互项响应面坡度陡且等高线较密集，呈椭圆形，说明这两者交互作用对共发酵产蛋白酶有较大影响，与响应面试验方差分析结果一致；由图11b可知，在初始pH 5.2～5.8、乙醇体积分数4%时蛋白酶活力最高；由图11c可知，当培养温度27～33 ℃、乙醇体积分数4%～5%时蛋白酶活力达到峰值，而后发酵液的蛋白酶活力随着培养温度和乙醇体积分数的变化而降低。

　　如图12a可知，在培养温度27～33 ℃、初始pH 5.2～5.8范围内，发酵液的总酯质量浓度最高，3D曲面的坡度较为平整，等高线呈圆形，说明初始pH值与温度的交互作用对共发酵产酯的影响不大。当培养温度为30 ℃时，在初始pH 5.2～5.8、乙醇体积分数3%～5%范围内总酯的质量浓度最高；初始pH值和乙醇体积分数交互的等高线图呈现椭圆形且等高线较为密集，说明这两个因素的交互作用对总酯质量浓度的影响较大（图12b）；当共发酵初始pH 5.0时，在培养温度27～33 ℃、乙醇体积分数3%～5%的范围内发酵液总酯质量浓度最高，之后随着培养温度和乙醇体积分数的变化而减小（图12c）。

　　回归方程模型预测共发酵最佳产蛋白酶和总酯的条件为初始pH 5.6、培养温度30.1 ℃、乙醇体积分数3.9%，此时蛋白酶活力为41.36 U/mL，总酯质量浓度为5.75 g/L。根据实际情况，调整预测条件进行验证实验，在初始pH 5.6、培养温度30 ℃、乙醇体积分数3.9%的条件下蛋白酶活力为41.59 U/mL，总酯质量浓度为5.85 g/L，与预测值相符合。

　　如图13所示，与未发酵的酒醅相比，经过6 d发酵后酒醅中EC质量浓度显著下降（

　　P＜0.05），在6 d时实验组酒醅的EC降解率为27%，与对照组相比显著降低了12.7%。蒸馏取酒后，与原酒对照组（18.45 μg/L）相比，实验组的EC质量浓度（16.45 μg/L）显著下降了10.8%（P＜0.05）。

　　如图14所示，实验组挥发性风味物质质量浓度及种类数量都高于对照组，其中酸类的质量浓度提升了71.2%，酯类质量浓度提升了17.3%。综上，JX2-10和QX-2可以用于降低白酒发酵过程中EC的含量，并且对白酒挥发性风味物质的生成具有一定的促进作用。

　　本实验从3 种白酒大曲中通过纯化分离，并以EC为唯一碳源培养初筛以及检测EC降解酶活力复筛的方法得到5 株酵母菌和4 株细菌，进一步检测了酵母菌的产酯能力和细菌的产蛋白酶能力，结合产EC降解酶能力最终筛选出异常威克汉姆酵母QX-2（

　　W. anomalus）和解淀粉芽孢杆菌JX2-10（B. amyloliquefaciens），使用GC-MS法检测了2 株菌在24 h内的EC降解率。结果表明，QX-2的EC降解率为35%，JX2-10的降解率达到85%，2 株菌均对EC具有极强的降解能力。通过响应面试验设计优化得到JX2-10和QX-2的最佳共培养条件：初始pH 5.6、培养温度为30.1 ℃、乙醇体积分数为3.9%。此条件下蛋白酶活力为41.59 U/mL、总酯质量浓度为5.85 g/L，应用于白酒发酵能显著降低EC的含量并且能增强白酒的风味品质。本研究筛选得到的菌株具有优良的产蛋白酶和酯类能力，同时还兼具极强的EC降解能力。综上，JX2-10和QX-2具有在白酒发酵过程中消减EC的潜力，本研究对于提高白酒安全性和保障消费者的身体健康具有一定现实意义。

　　本文《白酒大曲中氨基甲酸乙酯降解菌株的筛选及共发酵培养条件的优化》来源于《食品科学》2025年46卷第5期151-160页，作者：李超伟，侯晓艳，张宿义，覃池，宋川，敖宗华，赵欢，张立强，李丝桐，赵润，刘书亮，胡凯弟，李琴，赵宁，李建龙。DOI:10.7506/spkx0520-162。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

　　实习编辑：俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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